用昆虫悬浮细胞高效生产杆状病毒

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　　一种用PEI转染昆虫悬浮细胞生产重组病毒的优秀方法。该方法可以在24孔板中同时转染多个目标和载体。我们实验室用FlashBac 系统转染SF9昆虫细胞，悬浮细胞培养所以操作流程都是基于该系统开发的。

　　A．PEI的制备

　　该操作流程是基于“Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells,” Chapter 12, in Expression Systems (eds. Dyson and Durocher). Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, UK, 2007.调整的。

　　1.取450 mL Milli-Q水放于500mL玻璃烧杯中。

　　2.加入500 mg PEI (Cat no. 23966-2; Polysciences)后，轻柔搅拌。

　　3.逐滴加入12 M盐酸至pH<2.0.

　　4.搅拌直至PEI溶解（——2-3h）。全程检测并保持pH<2.0。PEI完全溶解大约需要800 uL 12M的盐酸。有可能仍旧存在小的不溶颗粒。

　　5.逐滴加入浓氢氧化钠使溶液回到中性（pH7.0）。

　　6.使PEI溶液中性化大约需要500 uL 10M NaOH。

　　7.将PEI溶液倒入500 mL 量筒中，用Milli-Q水定容至500 mL。

　　8.通过真空过滤装置和0.22 um滤器对溶液过滤除菌。

　　9.按需分装冻存于-20 ℃。

　　B．细胞日常培养和维护

　　1.Sf9悬浮细胞用Gibco1 Sf-900TM III SFM medium (Cat. no. 12658-027, life technologies).进行培养。这作为一个母液。当活细胞数达到10x106后加入新鲜培养基传代。

　　2.从母液中取部分细胞加入到装有50mL 培养基的250mL锥形摇瓶中(Cat. no. 431144, Corning)。要求起始细胞密度为（0.7-0.8）x106个/mL。

　　3.在27℃，90rpm的摇床培养箱(Kuhner ISF-4-V: 50 mm 旋转直径)中培养稀释后的细胞。