Western Blot免疫印迹实验操作方法干货

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　　Western免疫印迹(western blot )是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

　　一、原理

　　免疫印迹与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

　　二、试剂准备

　　1、SDS-PAGE 试剂:见电泳实验。

　　2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

　　3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

　　4、0.01M PBS (pH7.4)：NaCl8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

　　5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS 中。

　　6、显色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。