快速响应的单细胞免疫印迹技术

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　　单细胞免疫印迹技术（scWestern），采用可扩展开放式的微孔阵列凝胶芯片，通过重力作用驱动细胞沉降落孔，经化学裂解细胞并整合SDS-PAGE电泳分离细胞裂解释放的蛋白质，后以短时间紫外线激发（——60s）激活光敏性凝胶，凝胶与蛋白质交联而固定蛋白质固定于凝胶内。紫外交联替代了传统western blot中繁琐的转膜流程，实现在4h内完成单细胞内多种蛋白的表达水平分析。scWestern结合了SDS-PAGE的分子筛效应，通过蛋白质的分子量和抗原抗体识别双重验证，保证了检测的特异性，可检测细胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内的蛋白，可区分经表观遗传修饰蛋白。单细胞免疫印迹技术可实现高通量、多指标共检，并在单细胞水平研究复杂细胞群体，在药物筛选、细胞异质性研究等方面具有重要的应用价值。

　　单细胞免疫印迹的核心—光敏感性蛋白质固定凝胶为基于二苯甲酮修饰聚丙烯酰胺凝胶BPMAC。BPMAC经紫外激活生成的中间体半衰期较短，且可非特异性与邻近X−H键（X = C, N, O, or S）反应，故而光敏固定效率较低。凝胶内背景噪音增加，背景荧光高，方法灵敏度低，难以应用于低丰度蛋白质的检测。另外，紫外激发波长较短（UVB，280——320nm），可能引起蛋白抗原位点失活，造成假阴性。

　　近日，上海交通大学丁显廷教授团队在Advanced Functional Material上发表了题为“A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-cell Immunoblotting”的文章。该文章报道了四唑修饰的新型光敏感性丙烯酰胺凝胶。该四唑交联丙烯酰胺凝胶将光敏基团与聚丙烯酰胺基团结合，将蛋白质分离功能和蛋白质光敏固定功能集合，具备以下技术优势：1）紫外激发波谱更窄且波长更长，能量更低。避免引起蛋白抗原位点失活及胶内高自发荧光背景。2）与蛋白分子的功能团聚合速度更快，极大提高蛋白固定效率，避免因聚合速度慢，蛋白扩散引起的灵敏度降低。3）不影响SDS-PAGE本身的分子筛效应，保留原方法的特异性及分离分辨率。4）不影响抗原抗体结合或受体配体结合或酶活性或适配体结合等。不影响后续检测体系的搭建。5）非选择性。可同时非选择性固定所有蛋白质，与蛋白质ProtCOO-反应。该凝胶的优良性能使其在毛细管、微流控芯片原位免疫印迹分析中具有广阔的应用前景，为应用单细胞免疫印迹分析技术研究低丰度蛋白的研究人员提供解决方案。