生物医药cdmo检测细胞增殖正确操作步骤

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　　一、实验方法原理
　　生物医药cdmo 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还原的 formazan 结晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。
　　二、实验材料
　　1.细胞样品
　　2.试剂、试剂盒：10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO
　　3.仪器、耗材：96 孔板 离心机 酶联免疫监测仪
　　三、实验步骤
　　1.接种细胞
　　用含 10% 胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul。
　　2.培养细胞
　　同一般培养条件，培养 3－5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
　　3.呈色
　　培养 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。
　　4.比色
　　选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。