悬浮细胞培养摇瓶在昆虫细胞培养中的应用

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　　细胞培养瓶是细胞培养中的一种耗材类产品，包括多种类型，其中悬浮细胞培养摇瓶是一种主要应用于悬浮细胞培养的耗材，尤其在昆虫细胞培养中应用比较多。

　　昆虫细胞是来自的一类，通过培养制造的病毒可作杀虫剂，基因片段可用来构建重组病毒以高效表达，生产某些药用蛋白。因此昆虫细胞的体外培养正逐渐成为生产用于和人类健康保健用的生物产品的重要手段。

　　利用悬浮细胞培养昆虫细胞可按以下步骤操作：

　　1、 将4 ml 含10%胎牛血清的完全昆虫细胞培养基加入一个25 cm2 悬浮细胞培养摇瓶。取出一支冻存Sf9细胞的安瓿，迅速置于37℃水浴，用手前后剧烈摇动融化之，当安瓿的内容物几乎完全融化时，将安瓿浸入70%乙醇，消毒外壁。

　　2. 打碎安瓿颈部，将内容物转移至25 cm2 培养瓶，用手轻轻摇动培养瓶，使细胞分散均匀，于27℃温育2——3 h 直到细胞贴壁。

　　3. 除去旧培养液，换5 ml 含10%胎牛血清的新鲜完全培养液。继续温育，每3天换液一次，直到细胞生长汇片。

　　4. 准备一个新的25 cm2 培养瓶，加入4 ml 含10%胎牛血清的完全培养液

　　5. 当Sf9细胞已生长汇片时，弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的完全培养液，用移液管轻柔吹打或用手掌轻拍培养瓶，重悬细胞。

　　6. 用为培养组织细胞所设计的血细胞计数器计数细胞，在25 cm2 培养瓶中接种1×106——2×106个细胞，摇动培养瓶使细胞均匀分布。于27℃温育，每3天用含10%FBS的完全培养基换液，直到培养瓶中的细胞生长汇片。

　　7. 弃去汇片的单层培养细胞中的培养液，并重悬细胞。

　　8. 用血细胞计数器计数细胞。以约4×105——5×105细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中。于27℃温育，以60——80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔，以保证充足的空气。

　　9. 每隔2——3天进行细胞计数，当细胞密度达到2×106——2×106细胞/ml 时进行传代， 将适量细胞移至一个含有新鲜完全培养液的新培养瓶中，使终密度达到4×105——5×105细胞/ml。或者，倒出适当体枳的细胞悬液，代之以新鲜培养液。