质粒工艺化生产流程解析

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　　质粒工艺化生产流程包括逐级放大的菌体扩增过程和下游纯化过程，细胞与基因治疗中最常用的载体AAV和慢病毒的生产都需要质粒作为起始材料，因此每年需要大量符合质量要求的质粒来满足下游细胞与基因治疗的市场需求。

　　质粒生产中面临的最大挑战是大规模的生产放大和纯化，即要维持高超螺旋结构质粒的比例，又要保持高纯度，以上两点无论对于DNA疫苗还是对于下游病毒生产的效率与质量 （如减少空壳率等）形成重大影响。

　　质粒通常在大肠杆菌中发酵扩增，提高大肠杆菌的生长密度可扩大质粒的产量。但细菌密度增加会带来溶氧不足的问题，不仅会降低质粒产量，还会导致质粒质量下降，具有超螺旋构象的质粒含量减少，给下游纯化工艺带来困难，也会间接提高生产成本。对大肠杆菌发酵过程中的溶氧量问题进行优化后，可使质粒产量提高1至50 倍。

　　大肠杆菌的裂解包含化学方法（碱、洗涤剂、酶、渗透冲击）和物理方法（加热、 剪切、搅拌、超声波和冻融），其中碱性裂解是最常用的方法。碱裂解步骤中，pH 的控制和适当有效的混合是关键，需要在狭窄的pH范围内使基因组DNA发生不可逆变性且质粒双链需要保持完整，大规模质粒生产中，裂解过程往往工艺重复性差， 难以控制；该阶段的质粒对剪切力非常敏感，质粒损失较大，超螺旋也容易丢失， 影响产量和质量。

　　质粒生产过程中常用层析法或色谱法进行纯化，不同开发阶段和使用级别对质粒的质量要求不同。质粒纯化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和内毒素以及非超螺旋的质粒变体，以满足针对目标产品的使用要求，纯化过程的优化可提高质粒产量、降低成本。质粒作为细胞与基因治疗药品的生产原料，需要对其理化性质进行鉴别，确保目的基因序列及整合无误；作为关键原材料或终产品，需要对其功能进行鉴定和控制；为保证安全性，对内毒素、杂菌污染和支原体残留的鉴别和检测的周期往往约30天左右，决定着质粒生产批次放行的周期；此外，质粒因为无法终端灭菌，因此需要全程在封闭且独立的生产车间进行，且要避免交叉污染，因此自动化、封闭式的系统是未来趋势。

　　当使用高拷贝数质粒、采用优化的发酵工艺可获得约1-2g/L的质粒，但目前行业内绝大部分公司的质粒产量不到0.5g/L，工艺优化的空间还非常广阔。质粒由于结构简单，且理化性质相似，因此构建一个平台化的生产和纯化工艺相对简单。质粒生产周期较短，上游发酵和下游纯化罐装工艺约需6天，但质粒的质量控制约需30天（主要对支原体等检测周期较长），质粒生产的年产能可达100批次。