CHO细胞系不稳定的原因、影响和应对策略

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　　以CHO细胞为基础所生产的重组蛋白在Fed-batch水平上可达到> 5g/L的产量。产量的提高部分归功于针对CHO细胞的各种遗传改造和不断优化的培养环境。一方面，基因组固有的易塑性允许这种可变性；但是这也促使CHO倾向基因组重排。结合高产细胞的基因组和代谢需求，在生物生产过程中CHO细胞的易塑性表现为细胞系的不稳定性，具体表现在产量和质量的下降。在这篇综述中，我们对产量和质量稳定性做了定义，并讨论了CHO细胞系不稳定的主要原因以及克隆选择和遗传操作方面的研究进展。我们还讨论了系统生物学方面的进展，这些进展可以为CHO细胞不稳定性的早期预测提供新策略，这将有助于识别那些表达水平在g/L级别的细胞系，而这些细胞系可在长时间培养过程中保持生产稳定，稳定细胞系构建服务且产品质量高度一致。

　　自2002年以来，已有316项生物治疗（包括生物仿制药和组合使用批准）被FDA批准。在过去四年中，每年新批准的生物治疗的数量一直保持稳定。截至2018年8月，已有5种新批准药物进入市场，包括4种单克隆抗体（erenumab、tildrakizumab、ibalizumab、rastuzumab）和1种仿制药蛋白药物（重组人促红细胞生成素）。从2002年至今的新批准类别中，mAbs（新型和新型适应症）占自2008年以来所有新药申请（NDA）和生物许可证申请（BLA）批准的22％，生物仿制药占30％。自2016年以来，CHO细胞系已被优先用于生产重组治疗药物，包括约70%的生物制药，以及所有已批准的单克隆抗体。已有研究表明CHO细胞具有多种可适应过程的特性，例如对遗传操作的易耐受性，易于适应生产规模，有快速生长速率以及可进行蛋白的翻译后修饰。在过去30年的生物制药发展中，建立起CHO细胞培养过程，并证明Fed-batch的蛋白产量可达到13 g/L。随着更深入地研究蛋白质功效的和法规遵从的重要性，在生物仿制药时代，上游工艺开发的新挑战生产大量具有电荷、大小和功效一致的重组蛋白。

　　也有人观察到，部分程度上，正是CHO细胞系核型的染色体重排和其他基因组变异，才促使那些能适应多种工艺的单细胞系出现。然而，也正是基因组的可塑性，在细胞培养过程中经常遇到的一个问题就是细胞在长时间的培养过程中，甚至在最终生物反应器规模的延长时间内，都可能会出现重组蛋白产量下降的情况。多种机制如基因丢失，基因沉默，以及不断增加的细胞压力敏感性确定是会造成细胞系的不稳定性。现已确定的是生产不稳定也可能是由于远端因素造成的，如增加的细胞凋亡和全基因组/表观基因组的改变。而这些不可预测的基因改变也会伴随着其他基因表达改变的风险，包括细胞内的糖基化、蛋白质折叠、蛋白酶和分子伴侣。此外，生物制药的生产过程易受温度、pH值、渗透压和氧传递的干扰，同时这些参数的变化可动态地干扰转录组。因此，局部基因和全宿主基因组偏差可能在不经意间就会导致产量下降，影响时间进程，增加成本，改变产品质量，并出现法规遵从性相关问题。有人还观察到，所选细胞的某些特性经常随时间而丧失，来自相同细胞群的克隆细胞的特性可能存在很大差异。总的来说，多个实验室都认为在生长和表型上CHO细胞表现出异质性，并随时间推移表现出基因组的不稳定性。因此造成蛋白生产稳定性不能随着时间推移而得到保证。