三维培养的步骤有哪些？

ningxueqin

　　单位培养并不是一步登天，他说需要经过一步步的去完成和实验的，那么三维培养的步骤有哪些？到底如何才能够真正的完成三维培养实验呢？下面我们一起来了解一下。

　　三维培养步骤一、复苏

　　1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

　　2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

　　3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

　　4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

　　5.3天换一次培养基。

　　三维培养步骤二、传代

　　1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

　　2.把原有培养基吸掉。

　　3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

　　4.细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

　　5.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

　　6.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

　　7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

　　8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

　　三维培养步骤三、 冻存

　　把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

　　冻存液的配制： 70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

　　三维培养细胞需要花费大量的人力物力以及财力，所以对于人力和财力以及物力的需求也是比较大的，一般的研究机构都不能够进行，目前在康宁平台当中就拥有三维培养细胞的案例，可以去看一看。