使用2D-LC-MS系统和UNIFI信息学工具对单克隆抗体效价和主要结构属性进行合规监测2023/2/27 14:08:58

知识***

　　本研究采用2D-LC/MS方法评估单克隆抗体(mAb)效价和确证产品质量数和糖基化谱图，同一平台被配置为第一维进行效价测定，第二维运用MS检测技术进行产品质量属性分析，充分展示了在单一平台上进行数据采集的简便性。

　　优势

　　通过将不兼容MS的方法与2D系统联用提升质谱检测能力。

　　在配备光学和/或质谱检测器的单一平台上使用1D和2D分析方法进行灵活分析。

　　利用合规UNIFI软件自动化采集和处理数据。

　　简介

　　二维液相色谱(2D-LC)广泛应用于整个生物制药行业。化学工程随着治疗药物变得越来越复杂以及人们不断探索新型药物，为了获取高质量数据，进而做出明智的决策，人们对分析方法和仪器性能的要求越来越高。各项行业举措也针对提升方法稳定性和操作合规性提出了额外要求。为满足这些不断变化的需求，我们研究了在UNIFI合规信息学平台上运行2D-LC联用高分辨率质谱的分析方法。该方法采用单中心切割配置，将Protein A亲和色谱与反相色谱/质谱联用(Pro A-RPLC-MS)，用于评估抗体效价及其主要结构属性。本研究的目的是开发出简单的实验设计，开发过程中参考了成功将Pro A与各种第二维分析联用的多篇文献报道1–3。

　　配备光学检测器的Protein A亲和色谱是对纯化细胞培养物中含Fc的分子进行定量分析的传统方法。在分析级分析中，上述分析对于需要选出最高产细胞系的克隆选择至关重要。确定高效价之后，还需要进行其它分析来评价产品质量属性。常用方法首先用制备型色谱或样品板捕获技术纯化细胞培养物，得到治疗性分子，然后对纯化得到的物质进行第一维(1D)分析，常用的技术包括体积排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)和反相完整质量数分析等。运用二维(2D)方法可省去大量的样品处理和下游处理工作。

　　本研究采用2D-LC-MS方法评估单克隆抗体(mAb)效价和确证产品质量数和糖基化谱图，同一平台被配置为第一维进行效价测定，第二维运用MS检测技术进行产品质量属性分析，充分展示了在单一平台上进行数据采集的简便性。

　　实验

　　样品描述

　　使用曲妥珠单抗制剂药(21 mg/mL)和0.1% (v/v)甲酸水溶液制备浓度为4 mg/mL的曲妥珠单抗储备液。进行二倍连续稀释，直至达到1D Pro A研究的光学检测限。

　　LC条件

　　系统：

　　使用2D技术的ACQUITY UPLC I-Class PLUS

　　四元溶剂管理器(QSM)(第一维)

　　二元溶剂管理器(BSM)(第二维)

　　检测器：

　　ACQUITY UPLC可变波长紫外(TUV)检测器(第一维)

　　波长：

　　280 nm

　　样品温度：

　　6 °C

　　进样体积：

　　2 μL

　　Protein A(第一维)

　　色谱柱：

　　POROS A 20 μm色谱柱，2.1 × 30 mm

　　柱温：

　　25 °C

　　流速：

　　1.000 mL/min

　　流动相A：

　　50 mM磷酸盐，150 mM NaCl，pH 7

　　流动相B：

　　500 mM乙酸

　　梯度：

　　第一维

　　反相(第二维)

　　色谱柱：

　　XBridge BEH C4蛋白分析专用柱, 300 ?, 3.5 μm, 4.6 × 50 mm(部件号：186004502)

　　柱温：

　　80 °C

　　流速：

　　0.500 mL/min(空闲状态0.100 mL/min)

　　流动相A：

　　水，0.1%甲酸(v/v)

　　流动相B：

　　乙腈，0.1%甲酸(v/v)

　　梯度：

　　第二维

　　MS条件

　　系统：

　　Vion IMS QTof

　　电离模式：

　　ESI+，灵敏度模式

　　质量数范围：

　　m/z 750～4000

　　毛细管电压：

　　2.75 kV

　　锥孔电压：

　　140 V

　　离子源温度：

　　150 °C

　　脱溶剂气温度：

　　600 °C

　　脱溶剂气流速：

　　600 L/h

　　锁定质量数参比化合物：

　　Glu血纤维蛋白肽B，浓度2.2 pmol/μL，溶于含0.1%甲酸(v/v)的水/乙腈(50:50)

　　数据管理

　　UNIFI科学信息系统1.9.4版

　　Vion IMS QTof驱动程序包2.2.0

　　结果与讨论

　　单克隆抗体的1D定量分析

　　配备光学检测器的Pro A色谱是评估mAb效价常用的高通量单一分析方法。传统的1D效价分析方法使用经过纯化的标准品生成标准曲线，然后进行线性回归拟合用于定量。图1所示为曲妥珠单抗稀释系列(0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL)所生成的校准曲线。稀释系列进样的叠加色谱图显示，保留时间重现性良好。峰面积(TUV，280 nm处)与进样浓度(mg/mL)的关系图呈现优异的相关性，这是该方法的典型特征(见插图)。

　　曲妥珠单抗标准品的Protein A亲和色谱图

　　图1.曲妥珠单抗标准品的Protein A亲和色谱图。图中所示为样品稀释系列的叠加图(标记有载样量)。制备样品的浓度范围是0.05-4 mg/mL，对应的载样量范围是0.1–8 μg(进样体积2 μL)。标准曲线(插图)显示峰面积与浓度在上述范围内呈线性相关。

　　完整mAb的RPLC-MS分析能够确认质量数并快速给出生物治疗药物产品的糖基化谱图，因此可以辅助克隆选择、工艺开发和工艺监测。尽管Pro A缓冲液组分不直接兼容质谱分析，但可以采用2D技术对第一维的目标分析物进行选择性的中心切割，然后将其转移至第二维色谱柱，使用兼容MS的洗脱溶液运行第二维分离。

　　在UNIFI平台上配置2D系统非常简单，成功创建系统后，用户就可以使用该系统在传统1D分析和2D工作流程之间轻松切换。用户可以通过Administration(管理)选项卡访问Device Management(设备管理)界面配置2D系统(图2)。先向新系统中添加第一维的组件，然后添加第二维的组件，UNIFI随后会按照添加顺序分配这些组件，以便于识别。当方法变得越来越复杂并且额外加装了泵，或者需要加装容纳捕集柱的色谱柱管理器用于多中心切割分析时，该方法尤为适用。

　　2D系统配置

　　图2.2D系统配置。配置色谱系统时，直接添加和移除列表中的可用仪器组件即可。用户可以“按顺序”添加第一维和第二维的模块，以便于区分。用户可以为1D和2D工作流程分别创建独立系统，并在采集数据之前进行选择。

　　采用图3所示的系统配置，用户既可以切换至传统1D工作流程(图3A)，又可以通过一系列阀切换操作调整现有系统，使其适用于2D工作流程，而无需对系统管路连接做任何更改。这样一来，当不需要质谱信息时，1D效价分析可作为高通量筛查的主力工具。当需要确认鉴定结果时，可执行第二次分析物进样，然后将中心切割部分转移至第二维(图3B)。确定中心切割窗口后，通过柱头稀释(ACD)将第一维和第二维液流合并。然后将阀切换回原始位置，再次隔离流路，随后即可运行第二维分离(图3C)。