质粒DNA的微量制备

ningxueqin

　　一、质粒DNA实验目的

　　1 ．了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；

　　2 ．掌握碱裂解法分离、纯化质粒DNA的方法。

　　二、基本原理

　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

　　质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

　　质粒的不相容性：利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞**同存在。

　　高碱：

　　细菌的细胞膜破裂，内容物释放。

　　染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

　　质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

　　高酸中和至中性：

　　变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物。

　　质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中。

　　纯化：

　　RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。

　　三、试剂及器材

　　1 ．试剂

　　溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲)

　　①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒 (保护作用)。

　　②EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）。

　　③Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）。

　　溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)。

　　①SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）。

　　②NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）。

　　溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离)。

　　①HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。

　　②KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。