结构生物学的研究 293F悬浮细胞表达重组蛋白

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　　分子细胞生物学的快速发展和对改良型药物的持续需求迫使结构生物学要更多的着眼于复杂蛋白的结构。这些蛋白需要特别的翻译后的修饰，分子伴侣和辅助因子来完成这种复杂的折叠并获得酶活性。蛋白数据库里的大量结构数据都是通过细菌表达系统获得的，原核蛋白不具有这些复杂修饰且缺乏真核蛋白基本的辅助因子。没有辅助因子对于大的多种亚基的蛋白复合物的研究带来问题，因为这些蛋白复合物是由小信号分子激活，细胞核、细胞表面的分泌蛋白都需要复杂的折叠机制。大量经过工程改造的大肠杆菌克服了一部分限制性的问题。近年来，哺乳动物细胞表达系统的使用越来越多，因为它能生产其它表达系统做不出来的真核蛋白。目前可以通过很多技术获得稳定表达和瞬时转染的细胞系，如化学转染法，电转法还有直接的注射法。然而这三种转染方法都有各自的优缺点，要么昂贵要么耗时。

　　悬浮细胞培养讲述了一种简单、快速、廉价在悬浮293F细胞中获得高产量蛋白的方法用于结构生物学的研究。瞬时共转293F细胞。293F细胞是从HEK293细胞中分离出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞。用价格便宜的分支型PEI配制的试剂瞬时转染细胞通过胞吞作用进行表达。这种方法适用于小规模30ml和大规模300ml的细胞转染，可以获得高产量的纯化蛋白。这对于要求复杂折叠机制、辅助因子，特别是翻译后修饰的蛋白研究是很有帮助的。

　　文章介绍了Sin3A转录抑制复合物 的三种主要骨架蛋白的表达和纯化。这三种蛋白是组氨酸脱乙酰酶（HDAC1），缺陷沉默抑制子（SDS3）和不依赖于转换的抑制子3（Sin3A).纯化出的蛋白复合物用于高通量的结晶化实验。

　　注释：操作步骤适合任何大规模的表达，因此试剂的体积需要成比例的增加。此操作步骤需要合适的哺乳系统表达载体。这里我们使用的是经过改造的pcDNA3.1表达载体，可以根据克隆的酶切位点方便的添加和去掉标签。以下是大规模转染的过程描述。