药物申报CAR-T血清总蛋白质的测定方法

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　　药物申报CAR-T血清总蛋白质的测定方法
　　1、凯氏定氮法仍然是建立各个具体方法时采用的参考标准方法。
　　2、双缩脲比色法是目前首先推荐的蛋白质定量方法。方法操作简便，虽然双缩脲试剂有大同不异。其中酒石酸钾纳可以稳定在碱性溶液中的铜离子，含有碘化物作为抗氧化剂。双缩脲反应生成的复合物其吸收峰为540nm。可采用*的标准牛血清白蛋白作为标准品，经称量，必要时用凯氏定氮法标定。各地质控中心提供的混合标准血清可作为第二参考，血清用量100μl，在10-120g/L浓度范围内呈良好线性关系，批内CV值<2%
　　3、染料结合法 蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑与考马亮蓝。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。
　　4、采用沉淀反应进行散射比浊法　用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择*试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度。
　　5、采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量　280nm 是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。尿酸和肝红素在280nm附近有干扰。紫外区200-225nm是肽健的强吸收峰。在此区域其吸收值为280nm的10-30倍，将血清稀释1000-2000倍可以消除干扰物质的影响。
　　6、基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚试剂比色法由于各种蛋白质分子中上述两种氨基酸的组成比例不同，特别是白蛋白含色氨酸为0.2%，而γ-球蛋白中含量达2%-3%，导致较大的差异。Lowry的改良法在酚试剂中加入Cu2++，集中原法和双缩脲反应两者的作用，使呈色灵敏度提高。其中75%的呈色依赖于Cu2++。反应产物*吸收峰在650-750nm，方法灵敏度为双缩脲方法的100倍左右。有利于检测较微量的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的干扰。
　　7、染料结合法 蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑与考马亮蓝。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。