GMP质粒外周血单个核细胞攻略

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　　GMP质粒外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）是外周血（即除骨髓以外的血液）中具有单个核的细胞的混合细胞群体，包括自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、T淋巴细胞（70%-90%）、B淋巴细胞。能够进一步分离纯化，是免疫细胞的主要来源。
　　单核细胞（monocyte）是血液中最大的白细胞，来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞，与各种细胞因子一起培养，可定向分化为巨噬细胞或树突状细胞等。注意不要把单个核细胞和单核细胞两者的概念混淆。
　　图1 单核细胞（左）和淋巴细胞（右）
　　PBMC是免疫系统的关键组成部分，作为免疫学、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗等方向最基础的实验原料被广泛使用。分离外周血单个核细胞成为了免疫细胞研究的基础，外周血单个核细胞比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。这样利用介于两者比重之间的溶液做密度梯度离心，就可得到单个核细胞。最常用的是聚蔗糖和泛影酸钠混合比重为1.070±0.001的溶液，国内常用泛影葡胺代替泛影酸钠。
　　PBMC分离提取操作步骤：
　　1）用无菌稀释液将血样稀释2-4倍；
　　2）在50ml锥底离心管中先加入15-20ml分离液，然后缓慢加入20-30ml经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上。（适当增加分离液的使用量，将有利于提高单个核细胞纯度）；
　　3）室温400g离心15-30min，保证转子速度平稳下降；
　　4）将离心管小心地从离心机中取出，缓缓地吸去最上层，避免接触单个核细胞层；
　　5）将单个核细胞层缓慢转移到另一支50ml锥底离心管中；
　　6）加入无菌洗涤液并混匀后，室温下300g离心10min，小心弃掉上清；
　　7）为了去除残余血小板，可将细胞重悬于30-50ml无菌洗涤液中，室温200g离心10-15min，小心弃掉上清；
　　8）可选择地重复第7步，将会去除绝大部分血小板；
　　9）将细胞用缓冲液或培养基重悬后进行检测、培养等后续操作。
　　此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的比重。
　　PBMC激活：
　　PBMC一般需要加细胞因子刺激，否则很快就会凋亡。推荐使用包被法。
　　1）六孔板 5μg/mL CD3 800μL（室温2h 或 4℃过夜）；
　　2）加入 RPMI-1640培养基(abs9484)+优级胎牛血清(abs972)+1μg/mL CD28+100IU/mL IL-2，细胞密度建议1-2×106/ml, 刺激2-3d；
　　细胞因子浓度、种类及细胞数量可根据自身实验目的调整。
　　PBMC冻存：
　　10% DMSO(abs9187)+FBS(abs972)
　　1）制备含20%DMSO的FBS溶液，置于冰上。（100%DMSO在冰上会形成冰晶）;
　　2）确保PBMC为单细胞悬液。300×g离心10min，弃上清；
　　3）按1-20×106cells/mL的浓度将PBMC重悬于预冷的FBS中；
　　4）按1:1的比例将细胞和含20%DMSO的FBS混合。快速将1mL的细胞悬液转移到冻存管；
　　5）将冻存管立即放入梯度降温盒中，在-80℃的冰箱中放置过夜后立即转入液氮。
　　PBMC离体之后越快冷冻越能保证其活性及功能。当全血离体一段时间后，再使用Ficoll进行分离，中性粒细胞会被活化，从而严重影响密度梯度离心得到PBMC的效率，从静置24h后的模拟运输环境中分离得到的PBMC，其组分中T细胞和NK细胞含量会发生明显变化，对刺激的反应也会弱化。